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    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    ProtocolloDiclorofluoresceina (DCF) per analisi al FACS

    (RICORDA!! Il DCF è fotosensibile e tossico)

    Piastro 50.000 cellule in ogni pozzetto della 6-well in mezzo al 10% FBS, glutam, P/S e sodio piruvato.

    (Attenzione!! Nella preparazione dei campioni ricorda sempre di fare, oltre al controllo DCF=0 e S=0.5%,  i controlli non colorati ma stimolati (p.es DCF=0 S=10%, oppure DCF=0 S=10% H2O2= 200 µM)

    Dopo 24h wash-out e starvation con mezzo 0,5 % siero con glutam, P/S e sodio piruvato.

    Dopo 24h faccio la  colorazione (proteggendo le piastre dalla luce). Il DCF dal tubino originale va risospeso con 9 µl di DMSO e lo otterrò 10mM)

    Colorazione con DCF 25 µM  in mezzo allo 0,5 % siero con  glutam, P/S,  sodio piruvato per 30 min a 37 gradi.

    Poi due lavaggi con HBSS caldo e poi aggiungo HBSS 0,5% o 10% oppure 20% di FBS preparato prima.

    Serum stimulation 20 minuti a 37 gradi ( sempre proteggendo le piastre dalla luce).

    Poi un lavaggio con PBS caldo, poi 300 µl di tripsina e, quando si sono staccate, aggiungo 1,5 mL di HBSS con la percentuale di siero relativa alla stimolazione.

    Poi metto nei falcon da 15 mL e centrifugo a 1000 per 5 minuti.

    Poi aspiro e metto  subito il pellet in ghiaccio e lo risospendo con 600 µl di HBSS sempre con la stessa percentuale di siero relativa a quella della stimolazione.

    Filtro le cellule e porto al FACS Canto.