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    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    Protocollo Mitosox per analisi al FACS

    (RICORDA!! Il Mitosox è fotosensibile e tossico)

    Piastro 50.000 cellule in ogni pozzetto della 6-well in mezzo al 10% FBS, glutam, P/S e sodio piruvato.

    (Attenzione!! Nella preparazione dei campioni ricorda sempre di fare, oltre al controllo M=0 e S=0.5%,  i controlli non colorati ma stimolati (p.es M=0 S=10%, oppure M=0 S=10% Antim= 50 µM)

    Dopo 24h wash-out e starvation con mezzo 0,5 % siero con glutam, P/S e sodio piruvato.

    Dopo 24h colorazione (proteggendo le piastre dalla luce). Il Mitosox dal tubino originale va risospeso con 130µl di DMSO e diventa 500µM.

    Io devo ottenere una concentrazione finale di  Mitosox 2µM in  DMEM di starvation (allo 0,5 % siero con  glutam, P/S,  sodio piruvato)  preparato a parte. (Nei controlli positivi ho aggiunto l’antimicina A 50 µM che è sciolta in etanolo).

    Aspiro il mezzo di starvation e metto il mezzo al 0.5% siero con  glutam, P/S,  sodio piruvato + il Mitosox (attenzione!! Nel mezzo che aggiungerò ai non colorati devo comunque sostituire il Mitosox con il  DMSO).

    Colorazione 10 minuti a 37 gradi.

    Poi due lavaggi con HBSS caldo e poi aggiungo HBSS preparato prima allo 0,5% o 10% oppure 20% di FBS scomplementato .

    Serum stimulation 40 minuti a 37 gradi ( sempre proteggendo le piastre dalla luce).

    Poi un lavaggio con PBS caldo, poi 300 µl di tripsina e, quando si sono staccate, aggiungo 1,5 mL di HBSS con la percentuale di siero relativa alla stimolazione.

    Poi metto nei falcon da 15 mL e centrifugo a 1000 per 5 minuti.

    Poi aspiro e metto  subito il pellet in ghiaccio e lo risospendo con 600 µl di HBSS sempre con la stessa percentuale di siero relativa a quella della stimolazione.

    Filtro le cellule e porto al FACS Canto.