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    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    Microfluidica per mammalian cells

    Protocollo ottimizzato per caricamento e lancio di esperimenti di microfluidica per cellule di mammifero
    Microfluidica per mammalian cells

    schema del chip per cellule di mammifero

    Giorno 1: preparazione del chip

     

    MATERIALI

    • in lab al secondo piano bisogna prendere 4 cose:

    ◦       Tubo in PTFE Cole-Parmer

    ◦       stand per incubatore

    ◦       adattatori per il vuoto 20G

    ◦       chip (camera fredda)

    • dall'armadietto bisogna prendere:

    ◦       strippette

    ◦       una flask per la linea

    ◦       due falcon da 15 ml

    • in cucina bisogna prendere:

    ◦       una siringa da 2 ml

    ◦       una siringa da 10 ml

    ◦       tre aghi 22G

     

    PREPARAZIONE

    • controllare il chip sotto il microscopio per vedere se ci sono imperfezioni o ostruzioni
    • etichettare le due falcon come Terreno Completo (TC) e Cellule
    • mettere 8 ml di terreno nella falcon TC
    • fissare il chip al fondo della p100 con due pezzetti di scotch da autoclave. La superficie di adesione deve essere minima per evitare di rompere il vetrino quando poi dovrai staccarlo. ricordarsi di lasciare una linguetta per facilitare il peeling.

     

    WETTING

    • preparare la linea per il wetting:

    ◦       tagliare ~40cm di cavo (NB: i tagli si fanno sempre obliqui per facilitare l'inserimento nel chip)

    ◦       infilare l'ago nel cavo

    ◦       alzare leggermente il pistone della siringa da 2 ml e inserire l'ago col cavo

    • aspirare terreno dalla falcon TC con il capillare, facendo salire il livello fino a un paio di cm dall'ago
    • premere il pistone leggermente per far uscire una gocciolina ed evitare le bolle (questa cosa la ometto da ora in poi ma si fa SEMPRE quando si connette un cavo a una porta), e connettere il cavo a porta 5
    • premere il pistone (senza far schioppare il chip) fino a che non escono goccioline di terreno da porte 6, 7 e 2
    • staccare l'ago dalla siringa per rilasciare la pressione e riconnetterlo
    • staccare il cavo da porta 5 e connetterlo a porta 2
    • premere finche' non esce una gocciolina da porta 1
    • staccare il cavo dalla siringa, e rimuovere il cavo dal chip
    • staccare il cavo dall'ago e buttarlo; tappare l'ago e metterlo da parte con la siringa
    • coprire il chip, con le sue goccioline di terreno sulle porte, e metterlo da parte

     

    LOADING

    • Staccare le cellule, mantenere la linea e centrifugare tutto il resto (si parte da una T25)
    • mentre le cellule sono in centrifuga:

    ◦       attaccare gli adattatori per il vuoto alle porte 3 e 4

    ◦       preparare il tubo-prolunga dalla nostra cappa al microscopio e chiedere in prestito il tubo del vuoto dalla cappa accanto; attaccare le estremita' dei tubi al piano del microscopio con due pezzi di scotch abbastanza lunghi

    ◦       preparare cave per loading (20 cm di cavo + ago della siringa di prima)

    ◦       preparare cavo per flushing (30 cm di cavo + ago)

    • aspirare il surnatante dalle cellule e risospendere il pellet in 80 - 150 ul. Il volume dipende dalla confluenza delle cellule. Spipettare bene per essere sicuri che le cellule siano ben separate.
    • posizionare il chip sotto il microscopio, senza attaccare i cavi del vuoto
    • connettere il cavo per il loading alla siringa da 2 ml (se non l'hai gia' fatto) e aspirare 10 cm di cellule
    • connettere le cellule a porta 2 e osservando al microscopio col 4x, premere il pistone finche' non cominci a vedere le cellule scorrere nel canale principale. Fermare il flusso giocando col pistone.
    • connettere il chip al vuoto
    • guardando dagli oculari, mantenere il flusso più' fermo possibile e se necessario picchettare sul cavo per far entrare le cellule nelle camerette
    • quando un numero sufficiente di cellule e' entrato nelle trappole, staccare la siringa dal cavo e il cavo dal chip.

     

    FLUSHING

    • mentre il vuoto sta ancora facendo riempire le camerette, connettere il cavo per il flushing alla siringa da 2 ml e aspirare del terreno dalla falcon TC
    • connettere il cavo a porta 1 e far scorrere quanto più' mezzo possibile, asciugando di tanto in tanto la goccia che esce da porta 2, senza pero' mai mandarla a secco.
    • prima che il mezzo finisca, staccare siringa e poi cavo.
    • mentre il vuoto sta ancora andando, o anche no se ha finito, si montano i cavi sulle porte:

    ◦       su porta 2, si montano 2-3 cm di cavo annodato (va bloccato il flusso da quella porta);

    ◦       su porta 1, si montano 5-6 cm di cavo aperto (e' lo scarico)

    ◦       su porte 6 e 7, si monta un cavo piegato in due meta' uguali che connette le due porte (per bloccare il flusso) da quelle porte

     

     

    PERFUSIONE

    • staccare le linee del vuoto dagli adattatori, e poi gli adattatori del vuoto dal chip
    • portare il chip sotto cappa
    • inserire una fascetta autostringente nella parte alta dello stand (e lasciarla aperta, ovviamente)
    • preparare la linea per la perfusione:

    ◦       tagliare ~30 cm di cavo e connetterlo a un ago 22G

    ◦       scartare la siringa da 10 ml e rimuovere il pistone

    ◦       chiudere a occhiello il cavo dopo l'ago, e aggiungere nell'ago ~140-150 ul di TC per essere sicuri che non si formino bolle nell'ago. Lasciare una buona goccia di mezzo sopra l'ago

    ◦       connettere la siringa all'ago e versarci dentro tutto quello che rimane della falcon TC

    ◦       rilasciare l'occhiello e far scorrere il mezzo nel cavo

    ◦       connettere il cavo a porta 5

    • attaccare la siringa allo stand legandoci attorno la fascetta autostringente. La siringa deve stare più in alto possibile per evitare che l'ago pieghi e buchi il cavo.
    • collocare la petri con il chip nello stand
    • controllare sotto il microscopio che ci sia flusso nella direzione corretta (qualche detrito o cellula, scuotendo il cavo di perfusione, dovrebbe procedere da porta 5 a porta 1)
    • incubare ON

     

    Giorno 2: lancio esperimento

     

    PRIMA DI INIZIARE

    • accendere il microscopio e tutti gli annessi (lampada, CO2, incubatore)
    • accendere matlab e andare in una cartella che contenga gli script stepperDOWN() e stepperUP()
    • staccare e riattaccare la presa usb nera frontale (è quella che connette le guide delle siringhe)

     

    MATERIALI

    • da prendere in stanza cellule, sotto cappa:

    ◦       una falcon con 50 ml di TC

    ◦       una falcon da 15 ml con 10 ul di doxiciclina, stock solution 1 ng/ul

    • da prendere in cucina:

    ◦       5 siringhe da 50 ml

    ◦       5 aghi 22G

    • in lab al secondo piano trovi:

    ◦       tubo in PTFE (Cole-Parmer®)

    ◦       forbici

    ◦       scotch da autoclave

     

    PREPARAZIONE LINEE FLUIDICHE

    • nella stanza del microscopio, preparare e fissare al bordo del tavolo 11 pezzi di nastro telato:

    ◦       6 lunghi circa 30 cm

    ◦       5 lunghi circa 10 cm

    • in lab, sul proprio bancone, preparare 5 linguette di scotch per fissare i cavi alle siringhe
    • aprire una siringa e rimuovere il pistone (lo teniamo da parte ma non lo buttiamo ancora)
    • tagliare (sempre con taglio obliquo) una porzione di tubo in PTFE della lunghezza dell'apertura delle braccia di un uomo di media altezza (per me considero le mie braccia più una decina di cm)
    • attaccare l'estremità tagliata con una linguetta di scotch alla meta' inferiore dell'esterno della siringa (sopra il presunto livello del mezzo, ma abbastanza in basso da lasciare spazio per il nastro telato
    • connettere l'altra estremità a un ago, e l'ago alla siringa
    • con una strippetta da 10 ml, mettere 9 ml di terreno completo nella siringa, facendo attenzione a dirigere il flusso verso il bordo della siringa e a non creare bolle. Tenere sempre la siringa verticalmente.
    • controllare che il mezzo fluisca nel cavo senza formare bolle e portare la siringa nella stanza del microscopio
    • usare due pezzi di nastro telato lunghi per attaccare la siringa al muro (2 siringhe a 23 cm, 1 siringa a 46 cm, 2 siringhe sulle guide)

    ◦       il primo pezzo di scotch va subito sotto la parte alta

    ◦       il secondo va un 2-3 cm sotto il primo

    ◦       ogni siringa dev'essere ulteriormente fissata lateralmente con due pezzi di nastro telato corti, che vanno posizionati perpendicolarmente a quelli lunghi, per stabilizzarli (le siringhe con poco scotch hanno la brutta abitudine di cadere una decina d'ore dopo). Le siringhe di porta 1 e 2 devono essere attaccate alla stessa altezza e molto vicine, quindi un unico pezzo di nastro telato corto può essere usato per fissare la parte in mezzo.

    • le prime tre siringhe (1, 2, 5) vanno preparate e attaccate come sopra.
    • la siringa con mezzo non trattato (6) si prepara come sopra con le seguenti differenze:

    ◦       si mettono 10 ml di mezzo non trattato

    ◦       si attacca alla guida di destra, utilizzando un pezzetto di nastro telato per fissarla. NB: si può utilizzare il movimento delle guide per abbassare e poi rialzare il punto di aggancio, in modo da raggiungerlo più facilmente.

    • la siringa con doxiciclina si prepara come sopra con le seguenti differenze:

    ◦       si mettono 10 ml di mezzo nella falcon da 15 ml nella quale avevamo messo la doxiciclina; poi si prende il tracciante fluorescente (sulforodammina o ATTO425) dal frigo:

    ▪       sulforodammina: e' il tracciante rosso. Se ne mettono 5 ul

    ▪       ATTO425: e' il tracciante blu. Si agita vigorosamente per qualche minuto (e' poco solubile e tende a depositarsi). Insistere violentemente e a lungo. Poi se ne mettono 10 ul

    ▪       si attacca alla guida di sinistra, utilizzando un pezzetto di nastro telato per fissarla.

     

    CONNESSIONE CHIP

    • si va a prendere il chip, che ha riposato overnight, in camera cellule, e si poggia sul tavolo del microscopio.
    • si prende uno strappo di scottex e lo si ripiega più volte fino a ottenere un quadratino spesso, di lato circa 5 cm, e si bagna con una goccia di alcol denaturato
    • si connettono le linee una ad una:

    ◦       si stacca, molto lentamente in modo da lasciare una gocciolina sulla porta, il cavo della perfusione (porta 5) e lo si riattacca con un pezzetto di scotch in alto sulla sua siringa in modo da non farlo gocciolare

    • a questo punto si può rimuovere la p100 dallo stand, che viene messo da parte.
      • si prende il cavo della siringa 5 (46 cm) e si fa gocciolare un paio di gocce sullo scottex, che serve appunto a non sporcare pavimento e tavolo con il mezzo, poi rapidamente si connette alla porta. Si asciugano eventuali altre gocce,
      • nell'ordine, si staccano (sempre lentamente in modo da non far entrare bolle nei buchi) e si connettono i cavi di:
        • porta 1
        • porta 2
        • porta 6: in questo caso, si fa scendere la siringa, si prende il cavo e, tenendone l'estremità nello scottex, la si fa passare dallo sportello laterale dell'incubatore, poi attraverso quello frontale, e si connette poi a porta 6. Poi si rialza la siringa.
        • porta 7: stesso passaggio di porta 6. È FONDAMENTALE CHE LA SIRINGA DI PORTA 7, A PARTIRE DA ORA, SIA SEMPRE COSTANTEMENTE PIU IN BASSO DI PORTA 6.

     

    LANCIO ESPERIMENTO

    • ora si monta il chip sullo stage:

    ◦       si staccano le linguette di scotch che lo tenevano ancorato alla p100, moooolto lentamente perche' in questa fase si rischia di spaccare il vetrino con estrema facilita'

    ◦       si prende il vetrino per il PDMS, lateralmente, e si mette sullo stage facendo attenzione a non tirare i cavi e passando per lo sportello frontale. Generalmente e' meglio orientarlo seguendo il verso naturale dei cavi.

    ◦       si mettono gli spessori di vetro al lato del vetrino e si blocca sullo stage

    ◦       si fermano i cavi sullo stage utilizzando dello scotch. Si consiglia di seguire il verso dei cavi. Solitamente i cavi 6-7 (a volte con il 5) verranno fermati a destra, mentre 1-2 (a volte con il 5) verranno fermati davanti.

    ▪       i cavi 6-7 si fermano con un altro pezzo di scotch subito all'uscita dello sportello laterale, in modo da assicurarsi che ci sia abbastanza cavo per far muovere le siringhe.

    ◦       si chiude meglio possibile il vetro sull'incubatore, cercando di minimizzare gli spazi che inevitabilmente sono generati dai cavi in uscita.

    • si prendono i campi e si fa partire l'esperimento, più qualsiasi altro script matlab del caso.

     

    SMONTARE

    • staccare il chip dallo stage e portarlo fuori attraverso lo sportello frontale
    • staccare una alla volta le siringhe dalle guide (usando matlab per abbassarle se necessario) e farle passare dagli sportelli dell'incubatore fino a davanti per liberare i cavi
    • staccare le siringhe a muro e usare lo scotch per raggrupparle insieme
    • svuotare le siringhe nel lavandino
    • staccare gli aghi e il chip e buttarli nei rifiuti taglienti, il resto va buttato nel secchio giallo normale.