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    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    Ligasi con primers

    Come effettuare una ligasi utilizzando come inserto una corta sequenza double strand ottenuta dall'annealing di due primers.

    Protocollo per annealare 2 primers per fare un clonaggio (riassunto by Chiara del protocollo del lab Brunetti).
    Innanzitutto vanno disegnati in modo che siano già sticky quando si annealano.
    Si ordinano inoltre oligo normali, senza 5'P, e poi non si cippa il vettore (di modo che ci sia un donatore di 5'P); per la ligation, si usa un rapporto di 1:20 inserto:vettore.
    Alla fine della reazione, si corre il frammento (che per il protocollo da cui ho copiato era 88 bp) su gel 2% e si estrae la banda; in questo modo si vede se e' ds perché intercala EtBr.

    Mix:
    DNA+     5 ul     (da stock 100 uM)
    DNA-      5 ul     (da stock 100 uM)
    Buffer5x  10 ul     (qualsiasi buffer per PCR, io ho usato il GC della phusion)
    H2O       30 ul

    Temp melting dei primers: 75,8'C

    Programma:

    • 5 min @ 95'C
    • Discesa: da temp melting fino a 25'C, scendendo di un grado al minuto. Quindi, da 76 a 25 = 51 cicli, loop time = 1 min
    • Hold 25'C (oppure 4'C, come ho fatto io)

    poi correre su gel a 2%. Pero' per evitare un uso eccessivo di agarosio, io l'ho fatto al classico 0.8% con la mia banda di 51 bp ed e' andata benissimo :) La banda era così forte che si vedeva l'accumulo rosa di EtBr a occhio nudo, senza bisogno di transilluminatore.
    Poi ho estratto la banda e ho fatto un clonaggio classico con la Ligafast della Promega; ho fatto due rapporti, 1:20 e 1:30, ho trasformato 3 ul in TOP10 e ho piastrato tutta la trasformazione. Sono uscite le seguenti colonie:
    1:30 = ~4000
    1:20 = più di 4000 colonie
    controllo negativo = ancora di più di 4000 colonie
    Questo e' normale perché il vettore non era cippato: quando vengono meno colonie sul clonaggio che sul controllo negativo, vuol dire che l'inserto sta ostacolando la richiusura del vettore.
    Ho inoculato 12 colonie e ne sono risultate positive 6.