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    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    IRMA control experiments

    Introduzione

    Un esperimento di controllo realizzato in microfluidica prevede l’utilizzo di cellule di lievito (a cui è integrata la rete sintetica di geni IRMA) che devono essere opportunamente preparate nei giorni precedenti l’esperimento stesso. Le cellule devono essere prelevate dalla piastra di coltura e poste nel mezzo (SC + gal/raf) 48 ore circa prima che l’esperimento sia avviato; questa fase è detta inoculo delle cellule. Successivamente (24 ore prima dell’esperimento), le cellule devono essere diluite, dopo aver misurato la loro densità ottica con lo spettrofotometro. Inoltre, al fine di realizzare un esperimento, è anche necessario preparare i mezzi, gli zuccheri e tutti i dispositivi necessari alla realizzazione del controllo in vivo della popolazione di cellule. Di seguito sono presentati tutti gli step necessari per il set – up di un esperimento di controllo, dall’inoculo delle cellule sino al caricamento delle stesse nel dispositivo microfluidico.

    Piastratura lieviti

    La piastra finale sulla quale devono trovarsi i lieviti è la piastra fatta con SC -UWL+KAN+NAT in GLC. SC è il mezzo sintetico completo al quale sono tolti tre amminoacidi (Uracile (U), Triptofano (W), Leucina (L)), alla piastra sono aggiunti due antibiotici Canamicina (KAN) e nurseotricina (NAT). Quando facciamo la piastratura da un inoculo in GAL/RAF è in genere preferibile realizzare una selezione progressiva al fine di far esprimere alle cellule i geni selezionati dalle resistenze. Quindi la prima piastratura va fatta su una piastra con SC -UWL con 150microLitri di inoculo, spargendo il tutto sulla piastra con un’ansetta di vetro flambata dopo il passaggio in alcol. L’operazione di piastratura deve essere realizzata dopo che le piastre sono state prese dalla camera fredda e messe a riscaldare (aperte ma non totalmente scoperchiate) per 45 minuti in un incubatore. Dopo si procede alla piastratura (ogni piastra utilizzata va opportunamente etichettata scrivendo su di essa il mezzo e quali cellule vi sono) e, dopo, le piastre ottenute vanno messe chiuse (senza parafilm) a testa in giù nell’incubatore almeno per 2 giorni. Dopo i due giorni verificare visivamente che siano cresciute le cellule. Dopo si procede alla piastratura su piastre con SC -UWL+KAN ripetendo la stessa procedura riportata precedentemente. Successivamente le cellule vanno piastrate su piastre con SC -UWL+KAN+NAT (la nurseotricina va ordinata, vedere cartella ordini per l’ordine dell’antibiotico, il dosaggio è 100 microgrammi per ml).

    Preparazione mezzi

    48 ore prima dell’avvio di un esperimento di controllo o di un qualsiasi processo di analisi delle cellule di lievito in microfluidica è necessario prelevare le cellule dalla piastra e realizzare due inoculi.

    Preparazione del mezzo Sintetico Completo

    Il mezzo sintetico completo (SC) viene preparato da Ciro in cucina utilizzando la polvere SC-M; una volta preparato va filtrato o con una stericup o utilizzando gli appositi filtri che si montano sulle falcon; dopo aver filtrato il mezzo esso va aliquotato in falcon da 50 ml.

    Preparazione della soluzione di Glucosio al 20%

    In una beuta mettere 100 ml di acqua distillata e 20g di polvere di glucosio (glc); mettere ad agitare su un agitatore per tutta una notte senza riscaldamento. La soluzione ottenuta va filtra ed aliquotata; la conservazione è a +4°C.

    Preparazione della soluzione di Galattosio al 20%

    In una beuta mettere 100 ml di acqua distillata e 20g di polvere di galattosio (gal); mettere ad agitare su un agitatore per tutta una notte senza riscaldamento. La soluzione ottenuta va filtra ed aliquotata; la conservazione è a +4°C.

    Preparazione della soluzione di Raffinosio al 20%

    In una beuta mettere 100 ml di acqua distillata e 20g di polvere di raffinosio (raf); mettere ad agitare su un agitatore per tutta una notte senza riscaldamento. La soluzione ottenuta va filtra ed aliquotata; la conservazione è a temperatura ambiente.

    Preparazione del mezzo SC + gal/raf al 2%

    In una falcon da 50 ml vanno messi 40ml di SC, e 5ml di galattosio e raffinosio per totali 50 ml di mezzo.

    Preparazione del mezzo SC + glc al 2%

    In una falcon da 50 ml vanno messi 45ml di SC, e 5ml di glucosio 50 ml di mezzo.

    Prelievo delle cellule e preparazione di due inoculi

    Per iniziare un esperimento il giorno "0" le cellule vanno preparate a partire dai due giorni precedenti. Il giorno "-2" le cellule vanno prelevate con un'ansetta dalla piastra ed inoculate in 5 ml di SC+GLC@2%, la falcon ottenuta va messa nello yeast shaker a 30°C; il giorno "-1" le cellule vanno diluite in 10ml di SC+GAL/RAF@2%, questa diluizione viene fatta quando le cellule sono ad un'optical density di 1, ed in generale viene fatta prelevando 50ul di inoculo (la falcon ottenuta va messa sempre nello yeast shaker). Il giorno 0 le cellule sono sottoposte prima ad una misura dell'optical density e, poi, eventualmente utilizzate per l'esperimento di controllo. L'optical density alla quale vanno fatti li esperimenti (condizione ideale) è OD_600 = 1.

    Lettura Optical Density

    Questa procedura serve a leggere la densità delle cellule (ottenendo una indicazione approssimativa sul numero di cellule nell'inoculo) e, quindi, per diluirle in modo da arrivare all’inizio dell’esperimento con una popolazione di cellule viva, ma non troppo numerosa (curva di crescita dei lieviti in fase lineare). Per realizzare la lettura è necessario avere i campioni da analizzare (uno o più inoculi) ed il controllo negativo (il mezzo in cui non vi sono cellule). I campioni ed il mezzo vanno messi in delle apposite cuvette che sono poi collocate all’interno dello spettrofotometro al fine di contare le cellule. Si prelevano quindi le falcon con gli inoculi dallo shaker e si tiene vicino anche la falcon con il mezzo per generare la cuvetta di controllo, quindi nella prima cuvetta (controllo negativo) si mettono 900 micro litri di mezzo, nelle altre si mettono 900ul di mezzo e 100ul di inoculo; data il rapporto inoculo/mezzo in ciascuna cuvetta il valore dell'optical density misurato con lo strumento andrà moltiplicato per 10 per ottenere il valore reale. Con lo spettrofotometro si misura la densità ottica dei campioni, impostando come riferimento il valore ottenuto con la misurazione relativa al mezzo puro. Ogni campione prima di essere misurato deve essere agitato, quindi si prende la rispettiva cuvetta, e la si agita a testa in giù per almeno tre volte. In base ai risultati ottenuti con la lettura dell’optical density si procede poi con la diluizione degli inoculi effettuati 24 ore prima. la lettura è effettuata ad una lunghezza d'ona di 600nm.

    Set - up sperimentale dispositivo microfluidico e siringhe

    Per realizzare un esperimento in microfluidica è necessario disporre delle siringhe da collegare al dispositivo (tramite le sue 5 porte) durante l’esperimento oltre che della siringa per caricare le cellule all’interno del chip stesso. Inoltre bisogna avere le 5 siringhe più piccole delle precedenti necessarie durante la fase di “wetting” del dispositivo (serve per tirare fuori l’aria dai canali del chip prima che esso sia utilizzato).

    Preparazione siringhe

    I capillari sono ricavati tagliando, ad opportune lunghezze, un tubo di silicone. Delle 6 siringhe da 60 ml 2 servono per gli zuccheri e devono avere dei capillari più lunghi mentre le altre 4 possono avere capillari meno lunghi. La lunghezza dei capillari può essere misurata in “braccia” dell’operatore; i due capillari più lunghi devono misurare tre braccia, mentre quelli più corti due braccia.

    Le 5 siringhe più piccole possono essere siringhe da 2,5 ml, vanno riempite di acqua distillata filtrata, e devono avere collegate ad esse dei capillari di lunghezza pari ad un braccio.

    Ai capillari vanno collegati ad un estremo l’ago della siringa (aghi da 24g - colletto viola) all’altro i pin che vanno negli inlet del chip (aghi angolati da 22g); dopo aver assemblato ago capillare e pin, il complesso ottenuto va collegato alla siringa, tramite lo stantuffo va pompata aria 3 volte in ciascuna siringa al fine di eliminare impurità dalla siringa dagli aghi e dal capillare.

    Le siringhe con i mezzi vanno riempite come segue :

    • Galattosio: 10 ml di Sc+ gal/raf@2% + 5 micro litri di fluoroforo rosso (sulforodamina)
    • Glucosio: 10 ml di Sc+glc@2%
    • Le siringhe con l’acqua distillata (sono tre) vanno riempite con 5 ml ciascuna di acqua distillata e filtrata.
    • Le 5 siringhe piccole vanno riempite fino all’orlo con acqua distillata e filtrata.


    Dispositivo Microfluidico

    Il chip per l'esperimento va prelevato dalla piastra in cui è conservato ed ispezionato al microscopio (obiettivi 4X e 10X) per controllare la presenza di imperfezioni e residui di PDMS che ne possano eventualmente pregiudicare il funzionamento.

    Dopo il controllo del dispositivo, si passa alla fase di "wetting": con le siringhe da 2.5ml si riempie di acqua distillata il chip per far uscire tutta l'aria. Le sirignhe vanno collegate una alla volta alle rispettive porte, bisogna pompare delicatamente l'acqua all'interno del dispositivo dopo aver accuratamente controllato che nelle siringhe (e nei capillari ad esse collegati) non vi siano bolle d'aria.

    Dopo una ispezione al microscopio atta a verificare l'assenza di bolle d'aria all'interno del chip è possibile collegare le siringhe da 60mL al dispositivo. Di seguito, per ogni porta del chip, è indicato che siringa va collegata:

    Porta 1 e 2: zuccheri Porta 3: acqua distillata Porta 4: acqua distillata Porta 5: acqua distillata (siringa con cellule in fase di caricamento dei lieviti)

    Avvio esperimento di Controllo

    Per un esperimento di controllo si usa l'obiettivo da 40X ed il PFS. Una volta individuato il campo di acquisizione delle immagini e messo a fuoco, bisogna impostare l'acquisizione delle immagini ogni 5 minuti nell'ordine 1) bright field 2)green 3)red.

    Lo script di controllo (ambiente Matlab) va avviato dal pc e, a seconda del tipo di esperimento, richiederà differenti parametri di ingresso (vedere help allegato agli script di controllo).