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    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    Come impostare un esperimento di Time Lapse nelle chamber slide e come esportare dal formato .nd2 al .tif

    ACCENSIONE MICROSCOPIO E DISPOSITIVI COLLEGATI:

    Per una perfetta efficienza della lampada a fluorescenza e per garantire che nell'incubatore del microscopio la temperatura sia quella desiderata, si raccomanda di accendere il microscopio ed i dispositivi ad esso collegati nella seguente sequenza una mezz'ora circa prima dell'inizio di un esperimento:

      1) Microscopio (pulsante sul retro)

      2) Tutti gli altri componenti (comando stage - shutter - lampada a fluorescence) che sono nella mensola più in basso

      Nota: sulla mensola più in alto sotto al banco del microscopio ci sono il regolatore di temperatura e la pompa per aria e CO2, la loro accensione in un qualsiasi momento non pregiudica il corretto funzionamento del microscopio.

      3) Accendere il Pc se non è già acceso, per settare la temperatura nell'incubatore avviare il programma ‘’Oko ReadT’’ per impostare la temperatura

      - Function_cage set point --> 37gradi change ’’start →’’

       


       

       

        POSIZIONAMENTO DELLA CHAMBER SLIDE SULLO STAGE DEL MICROSCOPIO E SETTAGGI DEL SOFTWARE DEL MICROSCOPIO:

          Aprire la valvola della CO2
          Abbassare gli obiettivi, alzare la lampada e inserire le chamber slide negli appositi alloggi
          Riabbassare la lampada e rimettere in posizione gli obiettivi
          Avviare il programma NIS-Elements AR

          e svolgere le seguenti operazioni

          -Application_Define run experiment_scegliere la cartella in cui salvare l’esperimento

          -Time: in genere 15 minuti (dipende dal tipo di esperimento)

          -Lambda: BF, YFP, MCHERRY (mettili in ordine in modo che la macchina li acquisisca consecutivamente e spuntali)

          NELLA SEZIONE “DU897 SETTINGS”, FISSARE IL TEMPO DI ESPOSIZIONE: AD ESEMPIO

          SI INQUADRA L’IMMAGINE IN BF (PULSANTIERA FRONTALE DEL MICROSCOPIO>PULSANTE “EYE”) E SI SCEGLIE IL CAMPO

          POI SI PASSA IN LIVE (PULSANTE “R100” del microscopio e si sceglie il comando live (tasto play nel NIS))

          SI RISCALA L’IMMAGINE (PULSANTE IN ALTO A SN CON UNA DISTRIBUZIONE NORMALE E UN TRIANGOLO VERDE (Keep autoscale))

          SI SELEZIONA NELLA SEZIONE “DU897 SETTINGS” IL TEMPO DI ESPOSIZIONE. SE SEI IN BF, APPARIRA’ NELLA FINESTRA DELLA SCELTA FILTRI APPARIRA’ UN PUNTO ESCLAMATIVO VICINO ALLA SCRITTA BF: PREMERE COL DESTRO E CLICCARE “ASSIGN CURRENT CAMERA SETTINGS”. E’ FONDAMENTALE FARLO, ALTRIMENTI APPENA SI CAMBIA FILTRO SI PERDONO LE MODIFICHE APPORTATE.  OCCHIO A NON CLICCARE “ASSIGN CURRENT MICROSCOPE SETTINGS”, SOPRATTUTTO SE NON SEI ESPERTO E NON SAI RIMEDIARE. NON ESISTE IL TASTO ANNULLA!!!

          - Vai su ‘’live →’’ e clicca su ND ACQUISITION per fissare i campi.

          - Prima di fissare ogni campo setta il PFS, PUO’ RESTARE INSERITO DURANTE LA SCELTA CAMPI

          NB: Dato che il PFS ultimamente da' problemi perche' non riesce a reinserirsi tra un campo e l'altro, abbiamo trovato la seguente soluzione:

          - nel pannello "ND Acquisition", nella stessa tab dove si settano i campi (XY), DESELEZIONARE la casella "Include Z";

          - cliccare poi in basso su Advanced e SELEZIONARE la casella "Leave PFS offset ON between points"

          - Dopo aver impostato tutte le coordinate dei campi

          -clicca su ‘’one time loop’’ in modo da ottenere una verifica di tutti i campi, una sorta di giro di prova.

          OSCURA L’INCUBATORE CON L’APPOSITO PANNELLO

          - Fai partire il reale esperimento cliccando su ‘’Run now’’.

          SPEGNI IL MONITOR


           

          COME TERMINARE UN ESPERIMENTO E COME ESPORTARE I SINGOLI FRAMES IN FORMATO .TIF

          ALLA FINE DELL’ESPERIMENTO, CLICCARE SU “FINISH” IN UN MOMENTO DI PAUSA (TRA UN TIME POINT E IL SUCCESSIVO) PER TERMINARE L’ACQUISIZIONE. UNA FINESTRA TI CHIEDERA’ SE VUOI INTERROMPERE L’ESPERIMENTO DOPO IL CORRENTE TIME LOOP, GLI PUOI DIRE DI NO (ALTRIMENTI ASPETTERA’ DI CONCLUDERE IL TIME POINT SEGUENTE). ATTENZIONE A NON CLICCARE “ABORT” ALTRIMENTI CANCELLATE L’ESPERIMENTO!!!!

          PER GUARDARE L’ESPERIMENTO, SELEZIONARE IL CAMPO DALLA SECONDA RIGA SOTTO L’IMMAGINE E PREMERE PLAY NELLA PRIMA RIGA SOTTO L’IMMAGINE PER VEDERE IL FILMATO.

          PER ESPORTARE L’ESPERIMENTO:

          FILE > ND > EXPORT ND EXPERIMENT

          SELEZIONA LA CARTELLA. FARE ATTENZIONE CHE:

          • - SIA SELEZIONATO L’ORDINE “T > XY > C”
          • - IL FORMATO SIA TIF “TAGGED IMAGE FORMAT”
          • - IL QUADRATO “APPLY LUTS” NON SIA SPUNTATO
          • - SIA SELEZIONATO “MONO IMAGE FOR EACH CHANNEL”
          • - SIA SELEZIONATO “KEEP BIT DEPTH”