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Personal tools
    di Bernardo Lab - Systems and Synthetic Biology Lab
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    WET LAB

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    Our rules

    • A- si entra sempre e solo con camice e guanti (ognuno e' responsabile del proprio camice, quindi procurateveli, scriveteci il vostro nome e assicuratevi che siano puliti, niente scuse!)
    • B- per ogni laboratorio dovete avere un camice diverso: stanza cellule e laboratorio di biologia molecolare non possono condividere un camice!
    • C- quando fate un esperimento siete responsabili del vostro bancone (o cappa) per la durata dell'esperimento e per la pulizia successiva, considerate la pulizia come parte INTEGRANTE dell'esperimento
    • D- mettete sempre il vostro nome e la data sui campioni che state preparando.
    • E - Compilate il registro cancerogeni!!! (ECCO UN LINK AL  #Resgistro# )
    • F - READ THIS BEFORE STARTING TO WORK AT THE BENCH!!! #NORME COMPORTAMENTALI#

     



    Plasmids & Cells

    Instructions for plasmids' map and sequence

    • All the plasmids should be kept in GENBANK format. This format can be read by any software and allows to easily annotate all the sequences.
    • All the plasmids you use, can be downloaded in GENBANK from ADDGENE.
    • Once in ADDGENE you found your plasmid, click on 'Sequence' under 'Plasmid Links', then on 'Analyze Sequence' and from here you just click on 'GENBANK'.
    • Copy the sequence and paste it in TextWrangler (MAC) or Notepad (PC) and save it a txt plain text (not WORD or RTF format) in TextWrangler click on CONVERT TO ASCII
    • Now you can view and modify your plasmid with SerialCloner/GENIOUS or any other program

    Perform in-silico cloning using the following software

    Here you can find a tutorial on how to carry out in-silico cloning experiments

    Enzymes Inventory

    Here you can find the restriction enzymes

    The Plasmid and Cells Database

    All of the cells and plasmids must be stored in our database (Click here for instructions).



    FACS Analysis tool for Matlab

    PDF TUTORIAL

    In \data\wetlab\FacsAnalysis you will find a tool to analyze facs data with matlab.

    Instructions:

    • In matlab environment move to ...\data\wetlab\FacsAnalysis\ folder by typing "cd" followed by the entire path where the tool is in
    • Type in the command line: "FacsAnalysis" to start
    • Now you can import a facs file (.fcs 3.0 format), define a polygon to select the cells, plot and save data (.mat and .xls extensions are allowed)
    • A complete tutorial is available here, for any further information please contact Gianfranco

     

    Supply centre by Life Technologies - How to order

    PDF Tutorial

    Oligonucleotides' synthesis by Sigma - How to order

    • Fill in the excel file orders form indicating your name as "Reference", the project number and Sigma as Providing Company"
    • email a.calicchio@tigem.it with the form attached asking for the confirmation number
    • enter the confirmation number in the form (before the project number)
    • order online on the Sigma website and wait for the order confirmation
    • email gagliardi@tigem.it with the order form and the order confirmation (from Sigma) attached
    • save the two files in the "Orders" folder in Data for backup

    Nikon Eclipse - How to use it

     

    Filters mounted on the microscope

    Name: YELLOW GFP BP HYQ

    Ex 490 - 510
    Dm 515
    Em 520 - 550

    cod. MXU96211

    Pos. 4

    Use: YFP, Venus

    Name: UV-2A (DAPI)

    Ex 325 - 375
    Dm 400
    Em 420

    Pos. 5

    Use: Dapi

    Name: CYAN
    Ex 426 - 446
    Dm 455
    Em 460 - 500

    cod. MXU96210

    Pos.UN-MOUNTED

    Use: cyan

    Name: PSTN GFP

    Ex

    Dm

    Em

    cod. c128752

    pos: 2

    Use: green

    Name: TRITC HYQ

    Ex 530 - 560
    Dm 570
    Em 590  - 650
    pos.3
    Use: red dye and cherry

    Name: FITC

    Ex 465-495

    Dm 505

    Em 515-555

    Pos.1

    Use: GFP, Venus, YFP


      Plasma Cleaner

      General Infos

      PDMS bonding process

      Barbara, Lorena and Giansimone have been trained to use it, for enquiry contact Gianfranco


      Inventory


      Confocale

      Linee guida


      Reference Material

      • Microfluidics
      1. Fabrication of a microfluidic device, an example (Video)
      2. Microfluidics (wikibook)
      3. PDMS a review



        Protocols

            Rules

            REGOLE MICROSCOPI A FLUORESCENZA WET LAB

            1. Ogni ricercatore e responsabile di gruppo deve informare i nuovi borsisti che, prima di accedere ai microscopi per la prima volta, bisogna chiedere istruzioni a Marinella.
            2. Ricordate di prenotare il turno (1 ora) di cui avete bisogno sugli appositi fogli indicando sempre l'uso o meno della fluorescenza. Salvo casi eccezionali concordati in precedenza con la responsabile, ogni gruppo ha diritto ad un massimo di 3 turni al giorno di seguito (3 ore) e, soprattutto, tali turni di 3 ore per gruppo, non devono superare le 3 volte a settimana (fatta eccezione per scambi di turni non utilizzati, concordati prima con gli altri gruppi). Se non utilizzate più qualsiasi turno prenotato, cancellatevi in tempo in modo da dare spazio agli altri. Il foglio di prenotazione verrà affisso il Giovedì mattina da Marinella per permettere ai vari gruppi di prenotare i turni che spettano. Se il Lunedì i turni rimangono ancora inutilizzati, ogni gruppo può servirsene a proprio piacimento come turno extra a disposizione.
            3. La fluorescenza non deve essere accesa e spenta in continuazione perchè questi sbalzi limitano moltissimo la durata della lampada. Se dovete usarla nell'arco di mezz'ora, massimo un'ora, conviene lasciarla accesa oltre no.
            4. Ricordate di segnare sempre sugli appositi quaderni il tempo che avete lavorato e le ore segnate sull’indicatore della lampada a fluorescenza.
            5. Chiunque lavori ad immersione con olio deve avere cura di pulire bene il tavolino e gli obiettivi (anche quelli adiacenti) dopo l'uso: a lungo andare l'accumulo di olio tende a rovinare gli ingranaggi del microscopio.
            6. Non fate sostituzioni di obiettivi, pezzi o operazioni di sistemazione dei microscopi senza chiedere a Marinella.
            7. L'ultima persona prenotata, oltre a spegnere la lampada a fluorescenza, deve spegnere il microscopio. Per quelli Zeiss deve spegnere anche la telecamera: la presa collegata è ben visualizzata e basta tirarla.
            8. Cercate di lasciare il banco pulito senza abbandonare vetrini, guanti, piastre, carte e pezzi di ovatta sparsi ovunque
            9. Per i microscopi Zeiss e per lo stereomicroscopio Leica, le immagini salvate devono essere conservate nelle cartelle personali poste in DATI. Ogni 2 mesi si farà la “pulizia” dell’archivio DATI per cui Marinella vi avvertirà in tempo per permettervi di masterizzare le vostre immagini. Per lo stereomicroscopio, una volta salvate le immagini nelle proprie cartelle dati bisogna cancellarle dall'archivio del programma perchè esso ha un limite di memoria oltre il quale non è più possibile acquisire.
            10. Per il microscopio Leica è stato messo a punto un sistema di archiviazione specifico per cui la prima volta che accedete Marinella vi registrerà come nuovi utenti.

            Fluorimeter filters

            • wtGFP Ex 390nm Em 510nm
            • EGFP Ex 485nm Em 520nm (it works!!!)
            • dsRED Ex 544nm Em 590nm
            • Cherry-mRes Ex 590nm Em 610nm
            • Complete filter list
            • Contatto per il Fluorimetro Dott Stefano Berrilli, 02 93991 042 cell 335 42 86 35


            WET LAB

            On measuring promoter activity using fluorimeter


            Giusy tried the flurimeter with a CMV-EGFP in HeLa cells. It works perfectly if you remove the medium in the 12-well plate, no need to invert the optics.

            WET LAB

            Microfluidics devices

            I chip per microfluidica vengono realizzati nella clean room dell'IMM; a questa facility si accede previo appuntamento e con autorizzazione; vanno indossati tuta cuffia cappuccio guanti e calzari appositi; non vanno introdotti fogli di carta e tutto ciò che può generare microparticelle ed ogni altra cosa introdotta va prima pulita con l'aspira polvere (queste sono solo regole sommarie!!!)

            Contatti per accesso alla camera pulita

            Numeri di telefono

            • 592 clean room
            • 703 Vitaliano (tecnico della clean room)
            • 344 Mariano (ricercatore della clean room): mariano.gioffre (at) na.imm.cnr.it
            • 375 Luca, MAIL: luca.destefano (at) na.imm.cnr.it


            mail Emanuele Orabona

            • oraema(at) gmail.com


            Replica con il PDMS

            • Creare una vaschetta con i fogli di alluminio e posizionare al suo interno il master; (misurare le dimensioni della piastra in cui si è creata la vaschetta di alluminio tenendo presente che il cilindro di pdms dovrà avere l’altezza desiderata per il chip)
            • Versare il PDMS sulla bilancia mettendolo in una barchetta di plastica che si trova nella cassettiera della sala dove ci sono le cappe; dopo aggiungere l’agente curante. Mixare energicamente per qualche minuto il PDMS con il suo agente curante nel rapporto 1:10 (densità ~1g/cm3) [luglio 2012: nelle ultime lavorazioni per 53g di PDMS abbiamo usato 6.3g di curing agent, quindi un grammo in più perchè con le proporzioni consigliate il silicone finale era troppo molle.]; - EDIT by Chiara: a San Diego fanno 1:10 w/w, quindi per esempio per 40 g totali si mettono 36 g PDMS + 4 g di agente curante. La consistenza del chip effettivamente diventa perfetta e non si forma nessuna crepa mentre si fora con gli aghi.
            • Degasare in vuoto fino alla scomparsa di bolle superficiali (circa 1h); EDIT by Gianfranco: per rimuovere le bolle dal PDMS è possibile utilizzare il seguente protocollo (http://blogs.rsc.org/chipsandtips/2010/08/17/degas-pdms-in-two-minutes/): centrifugare a 3200 giri per 2 minuti il PDMS; quando si cola la mistura sul master potrebbero riformarsi delle bolle che vanno rimosse sempre utilizzando il degasser (in ogni caso si guadagna parecchio tempo).
            • Silanizzare il master per esposizione ai vapori di TMCS per 15min in un contenitore chiuso. Si consiglia di usare la soluzione di TMCS non più di 2 volte. ATTENZIONE: il TMCS reagisce violentemente con l’acqua formando acido cloridrico. SMALTIMENTO: Smaltire negli acidi mescolandolo con molta acqua (!!!)
            • Versare delicatamente sul master, cercando di evitare la comparsa di bolle d’aria. Se necessario degasare di nuovo. Per evitare la formazione di bolle bisogna versare non troppo velocemente il pdms e sopratutto da un’altezza non eccessiva. CONSIGLIO: il punto in cui si versa il PDMS deve essere al di fuori dell'area in cui sono presenti le strutture dei chip.
            • Posizionare su piastra (fredda!) a 80°C per 1h o più per facilitare la reticolazione del polimero;CONSIGLIO: utilizzare anche una temperatura leggermente maggiore di 80°.
            • Rimuovere delicatamente lo strato di PDMS dal master: questa operazione va fatta scontornando con un bisturi (taglio fatto a 2-3 mm all’interno del bordo del master) lo strato di PDMS, facendo attenzione a non graffiare il master (quindi l'incisione con il bisturi non deve essere fatta per tutta la altezza dello strato di PDMS); dopo bisogna delicatamente rimuovere questa corona circolare appena tagliata iniziando dal punto in cui essa sembra scollarsi più facilmente, una volta fatto ciò lo strato di silicone va alzato leggermente lasciando che sia la sua stessa forza elastica a farlo sollevare dal master.
            • Realizzare i fori di comunicazione necessari con aghi a punta piatta (svasati alla sommità), fare attenzione a quale ago si adopera; in genere, quando l’ago penetra nel pdms, non si dovrebbe avvertire una forte resistenza e, inoltre, bisogna cercare di far entrare l’ago facendo una rotazione accompagnata da una leggera pressione;CONSIGLIO: osservare prima le punte degli aghi al microscopio; è preferibile utilizzare aghi che hanno un profilo della punta che appare il più regolare possibile. dopo aver ultimato la foratura dei chip lavare gli aghi usati per 10 minuti in acqua e decon nel bagnetto ad ultrasuoni.
            • Pulire in alcool isopropilico per 10 min il pdms ed asciugare con azoto; CONSIGLIO: ripetere la pulizia anche più di una volta, fin quando tutti i detriti di PDMS generati durante la foratura sono spariti dalle porte e dai canali.
            • Facoltativo: deidratare il pdms su piastra per 15min a 80°C. (da fare solo se il bonding deve essere realizzato subito dopo la pulizia in alcol isopropilico, altrimenti basta che i dispositivi “riposino” almeno una notte).


            Bonding su vetro

            • Pulire i vetrini in ultrasuoni con : Acetone 10min. - DI Water 10min - Isopropanolo 10min.
            • Chiamare qualcuno che sia in grado di effettuare il plasma ossigeno (ricetta “PDMS bonding EMA”) tramite il RIE
            • Inserire nella camera il vetro ed il pdms necessari al completamento del dispositivo
            • Posizionare nel minor tempo possibile il PDMS sul vetro. Il bonding è istantaneo (o quasi)!

            IRMA control experiments

            Introduzione

            Un esperimento di controllo realizzato in microfluidica prevede l’utilizzo di cellule di lievito (a cui è integrata la rete sintetica di geni IRMA) che devono essere opportunamente preparate nei giorni precedenti l’esperimento stesso. Le cellule devono essere prelevate dalla piastra di coltura e poste nel mezzo (SC + gal/raf) 48 ore circa prima che l’esperimento sia avviato; questa fase è detta inoculo delle cellule. Successivamente (24 ore prima dell’esperimento), le cellule devono essere diluite, dopo aver misurato la loro densità ottica con lo spettrofotometro. Inoltre, al fine di realizzare un esperimento, è anche necessario preparare i mezzi, gli zuccheri e tutti i dispositivi necessari alla realizzazione del controllo in vivo della popolazione di cellule. Di seguito sono presentati tutti gli step necessari per il set – up di un esperimento di controllo, dall’inoculo delle cellule sino al caricamento delle stesse nel dispositivo microfluidico.

            Piastratura lieviti

            La piastra finale sulla quale devono trovarsi i lieviti è la piastra fatta con SC -UWL+KAN+NAT in GLC. SC è il mezzo sintetico completo al quale sono tolti tre amminoacidi (Uracile (U), Triptofano (W), Leucina (L)), alla piastra sono aggiunti due antibiotici Canamicina (KAN) e nurseotricina (NAT). Quando facciamo la piastratura da un inoculo in GAL/RAF è in genere preferibile realizzare una selezione progressiva al fine di far esprimere alle cellule i geni selezionati dalle resistenze. Quindi la prima piastratura va fatta su una piastra con SC -UWL con 150microLitri di inoculo, spargendo il tutto sulla piastra con un’ansetta di vetro flambata dopo il passaggio in alcol. L’operazione di piastratura deve essere realizzata dopo che le piastre sono state prese dalla camera fredda e messe a riscaldare (aperte ma non totalmente scoperchiate) per 45 minuti in un incubatore. Dopo si procede alla piastratura (ogni piastra utilizzata va opportunamente etichettata scrivendo su di essa il mezzo e quali cellule vi sono) e, dopo, le piastre ottenute vanno messe chiuse (senza parafilm) a testa in giù nell’incubatore almeno per 2 giorni. Dopo i due giorni verificare visivamente che siano cresciute le cellule. Dopo si procede alla piastratura su piastre con SC -UWL+KAN ripetendo la stessa procedura riportata precedentemente. Successivamente le cellule vanno piastrate su piastre con SC -UWL+KAN+NAT (la nurseotricina va ordinata, vedere cartella ordini per l’ordine dell’antibiotico, il dosaggio è 100 microgrammi per ml).

            Preparazione mezzi

            48 ore prima dell’avvio di un esperimento di controllo o di un qualsiasi processo di analisi delle cellule di lievito in microfluidica è necessario prelevare le cellule dalla piastra e realizzare due inoculi.

            Preparazione del mezzo Sintetico Completo

            Il mezzo sintetico completo (SC) viene preparato da Ciro in cucina utilizzando la polvere SC-M; una volta preparato va filtrato o con una stericup o utilizzando gli appositi filtri che si montano sulle falcon; dopo aver filtrato il mezzo esso va aliquotato in falcon da 50 ml.

            Preparazione della soluzione di Glucosio al 20%

            In una beuta mettere 100 ml di acqua distillata e 20g di polvere di glucosio (glc); mettere ad agitare su un agitatore per tutta una notte senza riscaldamento. La soluzione ottenuta va filtra ed aliquotata; la conservazione è a +4°C.

            Preparazione della soluzione di Galattosio al 20%

            In una beuta mettere 100 ml di acqua distillata e 20g di polvere di galattosio (gal); mettere ad agitare su un agitatore per tutta una notte senza riscaldamento. La soluzione ottenuta va filtra ed aliquotata; la conservazione è a +4°C.

            Preparazione della soluzione di Raffinosio al 20%

            In una beuta mettere 100 ml di acqua distillata e 20g di polvere di raffinosio (raf); mettere ad agitare su un agitatore per tutta una notte senza riscaldamento. La soluzione ottenuta va filtra ed aliquotata; la conservazione è a temperatura ambiente.

            Preparazione del mezzo SC + gal/raf al 2%

            In una falcon da 50 ml vanno messi 40ml di SC, e 5ml di galattosio e raffinosio per totali 50 ml di mezzo.

            Preparazione del mezzo SC + glc al 2%

            In una falcon da 50 ml vanno messi 45ml di SC, e 5ml di glucosio 50 ml di mezzo.

            Prelievo delle cellule e preparazione di due inoculi

            Per iniziare un esperimento il giorno "0" le cellule vanno preparate a partire dai due giorni precedenti. Il giorno "-2" le cellule vanno prelevate con un'ansetta dalla piastra ed inoculate in 5 ml di SC+GLC@2%, la falcon ottenuta va messa nello yeast shaker a 30°C; il giorno "-1" le cellule vanno diluite in 10ml di SC+GAL/RAF@2%, questa diluizione viene fatta quando le cellule sono ad un'optical density di 1, ed in generale viene fatta prelevando 50ul di inoculo (la falcon ottenuta va messa sempre nello yeast shaker). Il giorno 0 le cellule sono sottoposte prima ad una misura dell'optical density e, poi, eventualmente utilizzate per l'esperimento di controllo. L'optical density alla quale vanno fatti li esperimenti (condizione ideale) è OD_600 = 1.

            Lettura Optical Density

            Questa procedura serve a leggere la densità delle cellule (ottenendo una indicazione approssimativa sul numero di cellule nell'inoculo) e, quindi, per diluirle in modo da arrivare all’inizio dell’esperimento con una popolazione di cellule viva, ma non troppo numerosa (curva di crescita dei lieviti in fase lineare). Per realizzare la lettura è necessario avere i campioni da analizzare (uno o più inoculi) ed il controllo negativo (il mezzo in cui non vi sono cellule). I campioni ed il mezzo vanno messi in delle apposite cuvette che sono poi collocate all’interno dello spettrofotometro al fine di contare le cellule. Si prelevano quindi le falcon con gli inoculi dallo shaker e si tiene vicino anche la falcon con il mezzo per generare la cuvetta di controllo, quindi nella prima cuvetta (controllo negativo) si mettono 900 micro litri di mezzo, nelle altre si mettono 900ul di mezzo e 100ul di inoculo; data il rapporto inoculo/mezzo in ciascuna cuvetta il valore dell'optical density misurato con lo strumento andrà moltiplicato per 10 per ottenere il valore reale. Con lo spettrofotometro si misura la densità ottica dei campioni, impostando come riferimento il valore ottenuto con la misurazione relativa al mezzo puro. Ogni campione prima di essere misurato deve essere agitato, quindi si prende la rispettiva cuvetta, e la si agita a testa in giù per almeno tre volte. In base ai risultati ottenuti con la lettura dell’optical density si procede poi con la diluizione degli inoculi effettuati 24 ore prima. la lettura è effettuata ad una lunghezza d'ona di 600nm.

            Set - up sperimentale dispositivo microfluidico e siringhe

            Per realizzare un esperimento in microfluidica è necessario disporre delle siringhe da collegare al dispositivo (tramite le sue 5 porte) durante l’esperimento oltre che della siringa per caricare le cellule all’interno del chip stesso. Inoltre bisogna avere le 5 siringhe più piccole delle precedenti necessarie durante la fase di “wetting” del dispositivo (serve per tirare fuori l’aria dai canali del chip prima che esso sia utilizzato).

            Preparazione siringhe

            I capillari sono ricavati tagliando, ad opportune lunghezze, un tubo di silicone. Delle 6 siringhe da 60 ml 2 servono per gli zuccheri e devono avere dei capillari più lunghi mentre le altre 4 possono avere capillari meno lunghi. La lunghezza dei capillari può essere misurata in “braccia” dell’operatore; i due capillari più lunghi devono misurare tre braccia, mentre quelli più corti due braccia.

            Le 5 siringhe più piccole possono essere siringhe da 2,5 ml, vanno riempite di acqua distillata filtrata, e devono avere collegate ad esse dei capillari di lunghezza pari ad un braccio.

            Ai capillari vanno collegati ad un estremo l’ago della siringa (aghi da 24g - colletto viola) all’altro i pin che vanno negli inlet del chip (aghi angolati da 22g); dopo aver assemblato ago capillare e pin, il complesso ottenuto va collegato alla siringa, tramite lo stantuffo va pompata aria 3 volte in ciascuna siringa al fine di eliminare impurità dalla siringa dagli aghi e dal capillare.

            Le siringhe con i mezzi vanno riempite come segue :

            • Galattosio: 10 ml di Sc+ gal/raf@2% + 5 micro litri di fluoroforo rosso (sulforodamina)
            • Glucosio: 10 ml di Sc+glc@2%
            • Le siringhe con l’acqua distillata (sono tre) vanno riempite con 5 ml ciascuna di acqua distillata e filtrata.
            • Le 5 siringhe piccole vanno riempite fino all’orlo con acqua distillata e filtrata.


            Dispositivo Microfluidico

            Il chip per l'esperimento va prelevato dalla piastra in cui è conservato ed ispezionato al microscopio (obiettivi 4X e 10X) per controllare la presenza di imperfezioni e residui di PDMS che ne possano eventualmente pregiudicare il funzionamento.

            Dopo il controllo del dispositivo, si passa alla fase di "wetting": con le siringhe da 2.5ml si riempie di acqua distillata il chip per far uscire tutta l'aria. Le sirignhe vanno collegate una alla volta alle rispettive porte, bisogna pompare delicatamente l'acqua all'interno del dispositivo dopo aver accuratamente controllato che nelle siringhe (e nei capillari ad esse collegati) non vi siano bolle d'aria.

            Dopo una ispezione al microscopio atta a verificare l'assenza di bolle d'aria all'interno del chip è possibile collegare le siringhe da 60mL al dispositivo. Di seguito, per ogni porta del chip, è indicato che siringa va collegata:

            Porta 1 e 2: zuccheri Porta 3: acqua distillata Porta 4: acqua distillata Porta 5: acqua distillata (siringa con cellule in fase di caricamento dei lieviti)

            Avvio esperimento di Controllo

            Per un esperimento di controllo si usa l'obiettivo da 40X ed il PFS. Una volta individuato il campo di acquisizione delle immagini e messo a fuoco, bisogna impostare l'acquisizione delle immagini ogni 5 minuti nell'ordine 1) bright field 2)green 3)red.

            Lo script di controllo (ambiente Matlab) va avviato dal pc e, a seconda del tipo di esperimento, richiederà differenti parametri di ingresso (vedere help allegato agli script di controllo).

            Glycerol stock protocol (yeast)

            • Make a sterile solution of 30% glycerol (w/v)
            • Pipet 0.5 mL of the solution into sterile 2mL screw-cap vials.
            • Add 0.5 mL of a late log or early stationary phase culture, mix, freeze on dry ice and store at -80°C

            Plasticheria

            Il file excel con tutta la lista dei prodotti di plasticheria con relativi parametri (codice, prezzo e sconto) per il 2012 è disponibile in /data/ordini/Ordini 2012/lista_plasticheria_lab.xls (Link diretto al file)

            Come impostare un esperimento di Time Lapse nelle chamber slide e come esportare dal formato .nd2 al .tif

            ACCENSIONE MICROSCOPIO E DISPOSITIVI COLLEGATI:

            Per una perfetta efficienza della lampada a fluorescenza e per garantire che nell'incubatore del microscopio la temperatura sia quella desiderata, si raccomanda di accendere il microscopio ed i dispositivi ad esso collegati nella seguente sequenza una mezz'ora circa prima dell'inizio di un esperimento:

              1) Microscopio (pulsante sul retro)

              2) Tutti gli altri componenti (comando stage - shutter - lampada a fluorescence) che sono nella mensola più in basso

              Nota: sulla mensola più in alto sotto al banco del microscopio ci sono il regolatore di temperatura e la pompa per aria e CO2, la loro accensione in un qualsiasi momento non pregiudica il corretto funzionamento del microscopio.

              3) Accendere il Pc se non è già acceso, per settare la temperatura nell'incubatore avviare il programma ‘’Oko ReadT’’ per impostare la temperatura

              - Function_cage set point --> 37gradi change ’’start →’’

               


               

               

                POSIZIONAMENTO DELLA CHAMBER SLIDE SULLO STAGE DEL MICROSCOPIO E SETTAGGI DEL SOFTWARE DEL MICROSCOPIO:

                  Aprire la valvola della CO2
                  Abbassare gli obiettivi, alzare la lampada e inserire le chamber slide negli appositi alloggi
                  Riabbassare la lampada e rimettere in posizione gli obiettivi
                  Avviare il programma NIS-Elements AR

                  e svolgere le seguenti operazioni

                  -Application_Define run experiment_scegliere la cartella in cui salvare l’esperimento

                  -Time: in genere 15 minuti (dipende dal tipo di esperimento)

                  -Lambda: BF, YFP, MCHERRY (mettili in ordine in modo che la macchina li acquisisca consecutivamente e spuntali)

                  NELLA SEZIONE “DU897 SETTINGS”, FISSARE IL TEMPO DI ESPOSIZIONE: AD ESEMPIO

                  SI INQUADRA L’IMMAGINE IN BF (PULSANTIERA FRONTALE DEL MICROSCOPIO>PULSANTE “EYE”) E SI SCEGLIE IL CAMPO

                  POI SI PASSA IN LIVE (PULSANTE “R100” del microscopio e si sceglie il comando live (tasto play nel NIS))

                  SI RISCALA L’IMMAGINE (PULSANTE IN ALTO A SN CON UNA DISTRIBUZIONE NORMALE E UN TRIANGOLO VERDE (Keep autoscale))

                  SI SELEZIONA NELLA SEZIONE “DU897 SETTINGS” IL TEMPO DI ESPOSIZIONE. SE SEI IN BF, APPARIRA’ NELLA FINESTRA DELLA SCELTA FILTRI APPARIRA’ UN PUNTO ESCLAMATIVO VICINO ALLA SCRITTA BF: PREMERE COL DESTRO E CLICCARE “ASSIGN CURRENT CAMERA SETTINGS”. E’ FONDAMENTALE FARLO, ALTRIMENTI APPENA SI CAMBIA FILTRO SI PERDONO LE MODIFICHE APPORTATE.  OCCHIO A NON CLICCARE “ASSIGN CURRENT MICROSCOPE SETTINGS”, SOPRATTUTTO SE NON SEI ESPERTO E NON SAI RIMEDIARE. NON ESISTE IL TASTO ANNULLA!!!

                  - Vai su ‘’live →’’ e clicca su ND ACQUISITION per fissare i campi.

                  - Prima di fissare ogni campo setta il PFS, PUO’ RESTARE INSERITO DURANTE LA SCELTA CAMPI

                  NB: Dato che il PFS ultimamente da' problemi perche' non riesce a reinserirsi tra un campo e l'altro, abbiamo trovato la seguente soluzione:

                  - nel pannello "ND Acquisition", nella stessa tab dove si settano i campi (XY), DESELEZIONARE la casella "Include Z";

                  - cliccare poi in basso su Advanced e SELEZIONARE la casella "Leave PFS offset ON between points"

                  - Dopo aver impostato tutte le coordinate dei campi

                  -clicca su ‘’one time loop’’ in modo da ottenere una verifica di tutti i campi, una sorta di giro di prova.

                  OSCURA L’INCUBATORE CON L’APPOSITO PANNELLO

                  - Fai partire il reale esperimento cliccando su ‘’Run now’’.

                  SPEGNI IL MONITOR


                   

                  COME TERMINARE UN ESPERIMENTO E COME ESPORTARE I SINGOLI FRAMES IN FORMATO .TIF

                  ALLA FINE DELL’ESPERIMENTO, CLICCARE SU “FINISH” IN UN MOMENTO DI PAUSA (TRA UN TIME POINT E IL SUCCESSIVO) PER TERMINARE L’ACQUISIZIONE. UNA FINESTRA TI CHIEDERA’ SE VUOI INTERROMPERE L’ESPERIMENTO DOPO IL CORRENTE TIME LOOP, GLI PUOI DIRE DI NO (ALTRIMENTI ASPETTERA’ DI CONCLUDERE IL TIME POINT SEGUENTE). ATTENZIONE A NON CLICCARE “ABORT” ALTRIMENTI CANCELLATE L’ESPERIMENTO!!!!

                  PER GUARDARE L’ESPERIMENTO, SELEZIONARE IL CAMPO DALLA SECONDA RIGA SOTTO L’IMMAGINE E PREMERE PLAY NELLA PRIMA RIGA SOTTO L’IMMAGINE PER VEDERE IL FILMATO.

                  PER ESPORTARE L’ESPERIMENTO:

                  FILE > ND > EXPORT ND EXPERIMENT

                  SELEZIONA LA CARTELLA. FARE ATTENZIONE CHE:

                  • - SIA SELEZIONATO L’ORDINE “T > XY > C”
                  • - IL FORMATO SIA TIF “TAGGED IMAGE FORMAT”
                  • - IL QUADRATO “APPLY LUTS” NON SIA SPUNTATO
                  • - SIA SELEZIONATO “MONO IMAGE FOR EACH CHANNEL”
                  • - SIA SELEZIONATO “KEEP BIT DEPTH”

                  ProtocolloDiclorofluoresceina (DCF) per analisi al FACS

                  (RICORDA!! Il DCF è fotosensibile e tossico)

                  Piastro 50.000 cellule in ogni pozzetto della 6-well in mezzo al 10% FBS, glutam, P/S e sodio piruvato.

                  (Attenzione!! Nella preparazione dei campioni ricorda sempre di fare, oltre al controllo DCF=0 e S=0.5%,  i controlli non colorati ma stimolati (p.es DCF=0 S=10%, oppure DCF=0 S=10% H2O2= 200 µM)

                  Dopo 24h wash-out e starvation con mezzo 0,5 % siero con glutam, P/S e sodio piruvato.

                  Dopo 24h faccio la  colorazione (proteggendo le piastre dalla luce). Il DCF dal tubino originale va risospeso con 9 µl di DMSO e lo otterrò 10mM)

                  Colorazione con DCF 25 µM  in mezzo allo 0,5 % siero con  glutam, P/S,  sodio piruvato per 30 min a 37 gradi.

                  Poi due lavaggi con HBSS caldo e poi aggiungo HBSS 0,5% o 10% oppure 20% di FBS preparato prima.

                  Serum stimulation 20 minuti a 37 gradi ( sempre proteggendo le piastre dalla luce).

                  Poi un lavaggio con PBS caldo, poi 300 µl di tripsina e, quando si sono staccate, aggiungo 1,5 mL di HBSS con la percentuale di siero relativa alla stimolazione.

                  Poi metto nei falcon da 15 mL e centrifugo a 1000 per 5 minuti.

                  Poi aspiro e metto  subito il pellet in ghiaccio e lo risospendo con 600 µl di HBSS sempre con la stessa percentuale di siero relativa a quella della stimolazione.

                  Filtro le cellule e porto al FACS Canto.

                  Protocollo Mitosox per analisi al FACS

                  (RICORDA!! Il Mitosox è fotosensibile e tossico)

                  Piastro 50.000 cellule in ogni pozzetto della 6-well in mezzo al 10% FBS, glutam, P/S e sodio piruvato.

                  (Attenzione!! Nella preparazione dei campioni ricorda sempre di fare, oltre al controllo M=0 e S=0.5%,  i controlli non colorati ma stimolati (p.es M=0 S=10%, oppure M=0 S=10% Antim= 50 µM)

                  Dopo 24h wash-out e starvation con mezzo 0,5 % siero con glutam, P/S e sodio piruvato.

                  Dopo 24h colorazione (proteggendo le piastre dalla luce). Il Mitosox dal tubino originale va risospeso con 130µl di DMSO e diventa 500µM.

                  Io devo ottenere una concentrazione finale di  Mitosox 2µM in  DMEM di starvation (allo 0,5 % siero con  glutam, P/S,  sodio piruvato)  preparato a parte. (Nei controlli positivi ho aggiunto l’antimicina A 50 µM che è sciolta in etanolo).

                  Aspiro il mezzo di starvation e metto il mezzo al 0.5% siero con  glutam, P/S,  sodio piruvato + il Mitosox (attenzione!! Nel mezzo che aggiungerò ai non colorati devo comunque sostituire il Mitosox con il  DMSO).

                  Colorazione 10 minuti a 37 gradi.

                  Poi due lavaggi con HBSS caldo e poi aggiungo HBSS preparato prima allo 0,5% o 10% oppure 20% di FBS scomplementato .

                  Serum stimulation 40 minuti a 37 gradi ( sempre proteggendo le piastre dalla luce).

                  Poi un lavaggio con PBS caldo, poi 300 µl di tripsina e, quando si sono staccate, aggiungo 1,5 mL di HBSS con la percentuale di siero relativa alla stimolazione.

                  Poi metto nei falcon da 15 mL e centrifugo a 1000 per 5 minuti.

                  Poi aspiro e metto  subito il pellet in ghiaccio e lo risospendo con 600 µl di HBSS sempre con la stessa percentuale di siero relativa a quella della stimolazione.

                  Filtro le cellule e porto al FACS Canto.

                  Viable cell count

                  1. Check the chamber: it MUST be clean. If you can see some cells or other debris, clean it again with 70% ethanol and some paper and wait a few minutes until it dries.

                   

                   

                  1. Prepare the cell suspension: wash and trypsinize the cells in the vessel.  Check under the microscope approximately every minute for the cells to be detached and then inactivate the trypsin with complete medium at a 1:5 ratio. Make sure the cell suspension to be counted is well mixed. Transfer at least 10 ml into a 0.5 ml tube.
                  2. Mix an equal volume of trypan bleu (attention: it’s toxic!) to the cell suspension in the 0.5 ml tube, load a 10 ul volume of the mix into the chamber and go to the microscope.
                  3. Focus on the grid lines of the chamber and move to one set of 16 corner square as indicated by the diagram below.

                   

                  1. Count the cell number in this area of 16 squares, keeping separate the counts of the dead cells (blue stained) from the living ones (unstained).

                  Count only the cells within the square and any positioned on the right hand or top boundary line, to avoid counting twice some cells.

                  1. Move the chamber to another set of 16 squares and carry on counting until all 4 sets of 16 squares are counted.
                  2. Considering that the chamber is designed so that the number of cells in one set of 16 squares is equivalent to the number of cells multiplied by 104/ml, calculate the average of the living cells of the 4 counts from each set of 16 squares and than multiply the resulting number by 2, in order to adjust for the 1:2 dilution in trypan blue.
                  3. Calculate the cell suspension viability by dividing the living cell number by the total (living+dead cells) cell number and multiplying by 100.

                  Restriction Enzymes

                  Enzimi di Restrizione.xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 9 kB (9643 bytes)

                  CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Protocol

                  Reagent Preparation

                  1. Thaw the CellTiter-Glo. Buffer, and equilibrate to room temperature prior to use. For convenience the CellTiter-Glo. Buffer may be thawed and stored at room temperature for up to 48 hours prior to use.

                  2. Equilibrate the lyophilized CellTiter-Glo. Substrate to room temperature prior to use.

                  3. Transfer the appropriate volume (10ml for Cat.# G7570 and G7571, or 100ml for Cat.# G7572 and G7573) of CellTiter-Glo. Buffer into the amber bottle containing CellTiter-Glo. Substrate to reconstitute the lyophilized enzyme/substrate mixture. This forms the CellTiter-Glo. Reagent.

                  4. Mix by gently vortexing, swirling or inverting the contents to obtain a homogeneous solution. The CellTiter-Glo. Substrate should go into solution easily in less than 1 minute.

                   

                  Protocol for the Cell Viability Assay

                  1. Take the 96-well plate out of the incubator and equilibrate the plate and it’s content at room temperature for approximately 5 minutes.
                  2. Discard the culture media from every well and replace it with 50 μl of PBS after a fast wash in PBS.
                  3. Add 50 μl of CellTiter-Glo. to each well.
                  4. Mix contents for 2 minutes on an orbital shaker to induce cell lysis.
                  5. Allow the plate to incubate at room temperature for 10 minutes to stabilize luminescent signal.
                  6. Transfer the content from each well of the 96-well plate to a new opaque-walled multiwell plates
                  7. Prepare control wells containing PBS without cells and CellTiter-Glo. to obtain a value for background luminescence.
                  8. Record luminescence.

                   

                  Note: Uneven luminescent signal within standard plates can be caused by temperature gradients, uneven seeding of cells or edge effects in multiwell plates.

                  Note: Instrument settings depend on the manufacturer. An integration time of 0.25–1 second per well should serve as a guideline.

                  C2C12, C3H/10T1/2 and Hela


                  C2C12: vanno seminate a 1000 cellule vitali/cm2 per farle arrivare in 3
                  giorni ad una confluenza di max 70%.
                  Le C2C12 vanno scongelate a 2000 cellule vitali/cm2.
                  Inutile dirvi che vi é consentito mettere mano solo alla scatola della
                  working cell bank (WCB), le cui aliquote sono a un p4 e sono da 200000
                  cellule, per cui si scongelano in una T75.

                  Per la selezione di cloni stabili di C2C12, le concentrazioni di antibiotico da usare sono:

                  • G418: 600ug/ml
                  • Blasticidina: 3ug/ml

                   

                  C3H/10T1/2: vanno seminate a 1000 cellule vitali/cm2 per farle arrivare in 3-4 ad una confluenza massima di 70%.

                  Come le C2C12, anche i fibroblasti vanno scongelati ad una concentrazione doppia (2000 cellule vitali/ cm2).

                  Ho fatto cryovials di WCB da 200000 cellule, per cui potete anche non ricontarle allo scongelo e seminarle in 1 T75.

                  N.B. le etichette dalla WCB indicano un p4 ma in realtà sono un p5!!!

                  Trasfezione: Simona ha trasfettato i fibroblasti con il costrutto CBF1RE-d2EYFP seguendo il protocollo del Mirus. Ha ottenuto i risultati migliori andando a valutare dopo 48h al microscopio.

                  Per la selezione di cloni stabili delle C3H/10T1/2 la concentrazione di antibiotico da usare è:

                  - G418: 600ug/mL

                   

                  HeLa: vanno seminate a 10000 cellule vitali/cm2 per farle arrivare in 3
                  giorni ad una confluenza di circa l'80%.
                  Anche le HeLa vanno scongelate ad una densitá piú o meno doppia, per cui a
                  15000-20000 cellule vitali/cm2.
                  Essendo le aliquote della WCB da 1,1*10ˆ6 cellule, vanno scongelate anche
                  loro in una T75.

                  vi prego di farmi sapere quando vi restano piú o meno una decine di
                  aliquote di ogni WCB cosí da permettermi di produrne una nuova in tempi
                  ragionevoli.

                  Ligasi con primers

                  Come effettuare una ligasi utilizzando come inserto una corta sequenza double strand ottenuta dall'annealing di due primers.

                  Protocollo per annealare 2 primers per fare un clonaggio (riassunto by Chiara del protocollo del lab Brunetti).
                  Innanzitutto vanno disegnati in modo che siano già sticky quando si annealano.
                  Si ordinano inoltre oligo normali, senza 5'P, e poi non si cippa il vettore (di modo che ci sia un donatore di 5'P); per la ligation, si usa un rapporto di 1:20 inserto:vettore.
                  Alla fine della reazione, si corre il frammento (che per il protocollo da cui ho copiato era 88 bp) su gel 2% e si estrae la banda; in questo modo si vede se e' ds perché intercala EtBr.

                  Mix:
                  DNA+     5 ul     (da stock 100 uM)
                  DNA-      5 ul     (da stock 100 uM)
                  Buffer5x  10 ul     (qualsiasi buffer per PCR, io ho usato il GC della phusion)
                  H2O       30 ul

                  Temp melting dei primers: 75,8'C

                  Programma:

                  • 5 min @ 95'C
                  • Discesa: da temp melting fino a 25'C, scendendo di un grado al minuto. Quindi, da 76 a 25 = 51 cicli, loop time = 1 min
                  • Hold 25'C (oppure 4'C, come ho fatto io)

                  poi correre su gel a 2%. Pero' per evitare un uso eccessivo di agarosio, io l'ho fatto al classico 0.8% con la mia banda di 51 bp ed e' andata benissimo :) La banda era così forte che si vedeva l'accumulo rosa di EtBr a occhio nudo, senza bisogno di transilluminatore.
                  Poi ho estratto la banda e ho fatto un clonaggio classico con la Ligafast della Promega; ho fatto due rapporti, 1:20 e 1:30, ho trasformato 3 ul in TOP10 e ho piastrato tutta la trasformazione. Sono uscite le seguenti colonie:
                  1:30 = ~4000
                  1:20 = più di 4000 colonie
                  controllo negativo = ancora di più di 4000 colonie
                  Questo e' normale perché il vettore non era cippato: quando vengono meno colonie sul clonaggio che sul controllo negativo, vuol dire che l'inserto sta ostacolando la richiusura del vettore.
                  Ho inoculato 12 colonie e ne sono risultate positive 6.

                  Manuale tecnico T3000 thermocycler Biometra

                  pdf del manuale tecnico del termociclatore a 3 blocchi

                  Manual_T3000_Oct_2009.pdf — PDF document, 599 kB (613443 bytes)

                  Manuale riassuntivo T3000 thermocycler Biometra

                  Piccolo manuale minimalista riassunto da Chiara per l'uso del termociclatore a 3 blocchi

                  T3000 secondo me.pdf — PDF document, 203 kB (208489 bytes)

                  C2C12 transfection and stably cloning

                  C2C12 transfection and stable cloning.docx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.document, 128 kB (131192 bytes)

                  Procedura Supply Center

                  procedura supply centre Tigem.pdf — PDF document, 453 kB (464519 bytes)

                  Microfluidica per mammalian cells

                  Protocollo ottimizzato per caricamento e lancio di esperimenti di microfluidica per cellule di mammifero
                  Microfluidica per mammalian cells

                  schema del chip per cellule di mammifero

                  Giorno 1: preparazione del chip

                   

                  MATERIALI

                  • in lab al secondo piano bisogna prendere 4 cose:

                  ◦       Tubo in PTFE Cole-Parmer

                  ◦       stand per incubatore

                  ◦       adattatori per il vuoto 20G

                  ◦       chip (camera fredda)

                  • dall'armadietto bisogna prendere:

                  ◦       strippette

                  ◦       una flask per la linea

                  ◦       due falcon da 15 ml

                  • in cucina bisogna prendere:

                  ◦       una siringa da 2 ml

                  ◦       una siringa da 10 ml

                  ◦       tre aghi 22G

                   

                  PREPARAZIONE

                  • controllare il chip sotto il microscopio per vedere se ci sono imperfezioni o ostruzioni
                  • etichettare le due falcon come Terreno Completo (TC) e Cellule
                  • mettere 8 ml di terreno nella falcon TC
                  • fissare il chip al fondo della p100 con due pezzetti di scotch da autoclave. La superficie di adesione deve essere minima per evitare di rompere il vetrino quando poi dovrai staccarlo. ricordarsi di lasciare una linguetta per facilitare il peeling.

                   

                  WETTING

                  • preparare la linea per il wetting:

                  ◦       tagliare ~40cm di cavo (NB: i tagli si fanno sempre obliqui per facilitare l'inserimento nel chip)

                  ◦       infilare l'ago nel cavo

                  ◦       alzare leggermente il pistone della siringa da 2 ml e inserire l'ago col cavo

                  • aspirare terreno dalla falcon TC con il capillare, facendo salire il livello fino a un paio di cm dall'ago
                  • premere il pistone leggermente per far uscire una gocciolina ed evitare le bolle (questa cosa la ometto da ora in poi ma si fa SEMPRE quando si connette un cavo a una porta), e connettere il cavo a porta 5
                  • premere il pistone (senza far schioppare il chip) fino a che non escono goccioline di terreno da porte 6, 7 e 2
                  • staccare l'ago dalla siringa per rilasciare la pressione e riconnetterlo
                  • staccare il cavo da porta 5 e connetterlo a porta 2
                  • premere finche' non esce una gocciolina da porta 1
                  • staccare il cavo dalla siringa, e rimuovere il cavo dal chip
                  • staccare il cavo dall'ago e buttarlo; tappare l'ago e metterlo da parte con la siringa
                  • coprire il chip, con le sue goccioline di terreno sulle porte, e metterlo da parte

                   

                  LOADING

                  • Staccare le cellule, mantenere la linea e centrifugare tutto il resto (si parte da una T25)
                  • mentre le cellule sono in centrifuga:

                  ◦       attaccare gli adattatori per il vuoto alle porte 3 e 4

                  ◦       preparare il tubo-prolunga dalla nostra cappa al microscopio e chiedere in prestito il tubo del vuoto dalla cappa accanto; attaccare le estremita' dei tubi al piano del microscopio con due pezzi di scotch abbastanza lunghi

                  ◦       preparare cave per loading (20 cm di cavo + ago della siringa di prima)

                  ◦       preparare cavo per flushing (30 cm di cavo + ago)

                  • aspirare il surnatante dalle cellule e risospendere il pellet in 80 - 150 ul. Il volume dipende dalla confluenza delle cellule. Spipettare bene per essere sicuri che le cellule siano ben separate.
                  • posizionare il chip sotto il microscopio, senza attaccare i cavi del vuoto
                  • connettere il cavo per il loading alla siringa da 2 ml (se non l'hai gia' fatto) e aspirare 10 cm di cellule
                  • connettere le cellule a porta 2 e osservando al microscopio col 4x, premere il pistone finche' non cominci a vedere le cellule scorrere nel canale principale. Fermare il flusso giocando col pistone.
                  • connettere il chip al vuoto
                  • guardando dagli oculari, mantenere il flusso più' fermo possibile e se necessario picchettare sul cavo per far entrare le cellule nelle camerette
                  • quando un numero sufficiente di cellule e' entrato nelle trappole, staccare la siringa dal cavo e il cavo dal chip.

                   

                  FLUSHING

                  • mentre il vuoto sta ancora facendo riempire le camerette, connettere il cavo per il flushing alla siringa da 2 ml e aspirare del terreno dalla falcon TC
                  • connettere il cavo a porta 1 e far scorrere quanto più' mezzo possibile, asciugando di tanto in tanto la goccia che esce da porta 2, senza pero' mai mandarla a secco.
                  • prima che il mezzo finisca, staccare siringa e poi cavo.
                  • mentre il vuoto sta ancora andando, o anche no se ha finito, si montano i cavi sulle porte:

                  ◦       su porta 2, si montano 2-3 cm di cavo annodato (va bloccato il flusso da quella porta);

                  ◦       su porta 1, si montano 5-6 cm di cavo aperto (e' lo scarico)

                  ◦       su porte 6 e 7, si monta un cavo piegato in due meta' uguali che connette le due porte (per bloccare il flusso) da quelle porte

                   

                   

                  PERFUSIONE

                  • staccare le linee del vuoto dagli adattatori, e poi gli adattatori del vuoto dal chip
                  • portare il chip sotto cappa
                  • inserire una fascetta autostringente nella parte alta dello stand (e lasciarla aperta, ovviamente)
                  • preparare la linea per la perfusione:

                  ◦       tagliare ~30 cm di cavo e connetterlo a un ago 22G

                  ◦       scartare la siringa da 10 ml e rimuovere il pistone

                  ◦       chiudere a occhiello il cavo dopo l'ago, e aggiungere nell'ago ~140-150 ul di TC per essere sicuri che non si formino bolle nell'ago. Lasciare una buona goccia di mezzo sopra l'ago

                  ◦       connettere la siringa all'ago e versarci dentro tutto quello che rimane della falcon TC

                  ◦       rilasciare l'occhiello e far scorrere il mezzo nel cavo

                  ◦       connettere il cavo a porta 5

                  • attaccare la siringa allo stand legandoci attorno la fascetta autostringente. La siringa deve stare più in alto possibile per evitare che l'ago pieghi e buchi il cavo.
                  • collocare la petri con il chip nello stand
                  • controllare sotto il microscopio che ci sia flusso nella direzione corretta (qualche detrito o cellula, scuotendo il cavo di perfusione, dovrebbe procedere da porta 5 a porta 1)
                  • incubare ON

                   

                  Giorno 2: lancio esperimento

                   

                  PRIMA DI INIZIARE

                  • accendere il microscopio e tutti gli annessi (lampada, CO2, incubatore)
                  • accendere matlab e andare in una cartella che contenga gli script stepperDOWN() e stepperUP()
                  • staccare e riattaccare la presa usb nera frontale (è quella che connette le guide delle siringhe)

                   

                  MATERIALI

                  • da prendere in stanza cellule, sotto cappa:

                  ◦       una falcon con 50 ml di TC

                  ◦       una falcon da 15 ml con 10 ul di doxiciclina, stock solution 1 ng/ul

                  • da prendere in cucina:

                  ◦       5 siringhe da 50 ml

                  ◦       5 aghi 22G

                  • in lab al secondo piano trovi:

                  ◦       tubo in PTFE (Cole-Parmer®)

                  ◦       forbici

                  ◦       scotch da autoclave

                   

                  PREPARAZIONE LINEE FLUIDICHE

                  • nella stanza del microscopio, preparare e fissare al bordo del tavolo 11 pezzi di nastro telato:

                  ◦       6 lunghi circa 30 cm

                  ◦       5 lunghi circa 10 cm

                  • in lab, sul proprio bancone, preparare 5 linguette di scotch per fissare i cavi alle siringhe
                  • aprire una siringa e rimuovere il pistone (lo teniamo da parte ma non lo buttiamo ancora)
                  • tagliare (sempre con taglio obliquo) una porzione di tubo in PTFE della lunghezza dell'apertura delle braccia di un uomo di media altezza (per me considero le mie braccia più una decina di cm)
                  • attaccare l'estremità tagliata con una linguetta di scotch alla meta' inferiore dell'esterno della siringa (sopra il presunto livello del mezzo, ma abbastanza in basso da lasciare spazio per il nastro telato
                  • connettere l'altra estremità a un ago, e l'ago alla siringa
                  • con una strippetta da 10 ml, mettere 9 ml di terreno completo nella siringa, facendo attenzione a dirigere il flusso verso il bordo della siringa e a non creare bolle. Tenere sempre la siringa verticalmente.
                  • controllare che il mezzo fluisca nel cavo senza formare bolle e portare la siringa nella stanza del microscopio
                  • usare due pezzi di nastro telato lunghi per attaccare la siringa al muro (2 siringhe a 23 cm, 1 siringa a 46 cm, 2 siringhe sulle guide)

                  ◦       il primo pezzo di scotch va subito sotto la parte alta

                  ◦       il secondo va un 2-3 cm sotto il primo

                  ◦       ogni siringa dev'essere ulteriormente fissata lateralmente con due pezzi di nastro telato corti, che vanno posizionati perpendicolarmente a quelli lunghi, per stabilizzarli (le siringhe con poco scotch hanno la brutta abitudine di cadere una decina d'ore dopo). Le siringhe di porta 1 e 2 devono essere attaccate alla stessa altezza e molto vicine, quindi un unico pezzo di nastro telato corto può essere usato per fissare la parte in mezzo.

                  • le prime tre siringhe (1, 2, 5) vanno preparate e attaccate come sopra.
                  • la siringa con mezzo non trattato (6) si prepara come sopra con le seguenti differenze:

                  ◦       si mettono 10 ml di mezzo non trattato

                  ◦       si attacca alla guida di destra, utilizzando un pezzetto di nastro telato per fissarla. NB: si può utilizzare il movimento delle guide per abbassare e poi rialzare il punto di aggancio, in modo da raggiungerlo più facilmente.

                  • la siringa con doxiciclina si prepara come sopra con le seguenti differenze:

                  ◦       si mettono 10 ml di mezzo nella falcon da 15 ml nella quale avevamo messo la doxiciclina; poi si prende il tracciante fluorescente (sulforodammina o ATTO425) dal frigo:

                  ▪       sulforodammina: e' il tracciante rosso. Se ne mettono 5 ul

                  ▪       ATTO425: e' il tracciante blu. Si agita vigorosamente per qualche minuto (e' poco solubile e tende a depositarsi). Insistere violentemente e a lungo. Poi se ne mettono 10 ul

                  ▪       si attacca alla guida di sinistra, utilizzando un pezzetto di nastro telato per fissarla.

                   

                  CONNESSIONE CHIP

                  • si va a prendere il chip, che ha riposato overnight, in camera cellule, e si poggia sul tavolo del microscopio.
                  • si prende uno strappo di scottex e lo si ripiega più volte fino a ottenere un quadratino spesso, di lato circa 5 cm, e si bagna con una goccia di alcol denaturato
                  • si connettono le linee una ad una:

                  ◦       si stacca, molto lentamente in modo da lasciare una gocciolina sulla porta, il cavo della perfusione (porta 5) e lo si riattacca con un pezzetto di scotch in alto sulla sua siringa in modo da non farlo gocciolare

                  • a questo punto si può rimuovere la p100 dallo stand, che viene messo da parte.
                    • si prende il cavo della siringa 5 (46 cm) e si fa gocciolare un paio di gocce sullo scottex, che serve appunto a non sporcare pavimento e tavolo con il mezzo, poi rapidamente si connette alla porta. Si asciugano eventuali altre gocce,
                    • nell'ordine, si staccano (sempre lentamente in modo da non far entrare bolle nei buchi) e si connettono i cavi di:
                      • porta 1
                      • porta 2
                      • porta 6: in questo caso, si fa scendere la siringa, si prende il cavo e, tenendone l'estremità nello scottex, la si fa passare dallo sportello laterale dell'incubatore, poi attraverso quello frontale, e si connette poi a porta 6. Poi si rialza la siringa.
                      • porta 7: stesso passaggio di porta 6. È FONDAMENTALE CHE LA SIRINGA DI PORTA 7, A PARTIRE DA ORA, SIA SEMPRE COSTANTEMENTE PIU IN BASSO DI PORTA 6.

                   

                  LANCIO ESPERIMENTO

                  • ora si monta il chip sullo stage:

                  ◦       si staccano le linguette di scotch che lo tenevano ancorato alla p100, moooolto lentamente perche' in questa fase si rischia di spaccare il vetrino con estrema facilita'

                  ◦       si prende il vetrino per il PDMS, lateralmente, e si mette sullo stage facendo attenzione a non tirare i cavi e passando per lo sportello frontale. Generalmente e' meglio orientarlo seguendo il verso naturale dei cavi.

                  ◦       si mettono gli spessori di vetro al lato del vetrino e si blocca sullo stage

                  ◦       si fermano i cavi sullo stage utilizzando dello scotch. Si consiglia di seguire il verso dei cavi. Solitamente i cavi 6-7 (a volte con il 5) verranno fermati a destra, mentre 1-2 (a volte con il 5) verranno fermati davanti.

                  ▪       i cavi 6-7 si fermano con un altro pezzo di scotch subito all'uscita dello sportello laterale, in modo da assicurarsi che ci sia abbastanza cavo per far muovere le siringhe.

                  ◦       si chiude meglio possibile il vetro sull'incubatore, cercando di minimizzare gli spazi che inevitabilmente sono generati dai cavi in uscita.

                  • si prendono i campi e si fa partire l'esperimento, più qualsiasi altro script matlab del caso.

                   

                  SMONTARE

                  • staccare il chip dallo stage e portarlo fuori attraverso lo sportello frontale
                  • staccare una alla volta le siringhe dalle guide (usando matlab per abbassarle se necessario) e farle passare dagli sportelli dell'incubatore fino a davanti per liberare i cavi
                  • staccare le siringhe a muro e usare lo scotch per raggrupparle insieme
                  • svuotare le siringhe nel lavandino
                  • staccare gli aghi e il chip e buttarli nei rifiuti taglienti, il resto va buttato nel secchio giallo normale.

                   

                  Enzimi di Restrizione.xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 10 kB (10471 bytes)

                  Plasma Cleaner Main

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                  Plasma Cleaner Main
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                  Plasma Cleaner General Informations

                  What is Plasma? Click here to watch a movie!

                   

                   

                  Our System : Plasma System Type "Zepto" A equipped with vacuum pump (suitable for working with O2) and a 5 liters oxygen tank (and O2 pressure adapter)

                   

                  All the items are represented in the picture below; each of the symbols and or numbers refers to a part of the system. All the parts are named below the figure:

                  green rectangle - oil refill cap

                  yellow rectangle - window for oil level inspection

                  1 - Suction tube

                  2 - exhaust air outlet tube

                  3 - Chamber

                  4 - Main power switch

                  5 - Chamber pressure indicator

                  6 - Gas1 volume indicator

                  7 - Gas2 volume indicator

                  8 - Generator power regulator

                  9 - Timer

                  10 - Vacuum pump switch

                  11 - Generator switch

                  12 - Switch for chamber ventilation

                  13 - Gas1 needle valve

                  14 - Gas2 needle valve

                  15 - oxygen tank tap

                  16 - O2 adapter - tank barometer

                  17 - O2 adapter - output barometer

                  18 - O2 adapter - output regulator

                   

                  Enjoy,

                  Gianfranco

                  Plasma Cleaner Main2

                  Plasma Cleaner and accessories
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                  Size: 699.8 kB

                  Pdms bonding on glass

                  Pdms pieces and cover glasses should be perfectly clean before putting them into the machine, otherwise the process will not take place.

                   

                  Here the two stages protocol:

                   

                  1 - Before starting to operate the plasma cleaner, please check oil level looking into the inspection window (A-yellow rectangle); it should be between the two arrows on the left of the window.

                  2- turn on the machine with the main power switch (4)

                  First stage : Chamber cleaning

                  (this stage of the bonding process has to be executed every day the machine is used to increase the efficiency of the bonding process.)

                   

                  • Close the chamber (3),
                  • activate the pump by pressing the switch (10) and wait until the chamber pressure is near or below o.4 mbar (pressure indicator 5).
                  • Once the pressure is at the desired level, open the O2 tank and regulate the O2 adapter so that the pressure indicated by (17) is between 1 and 2 bar.
                  • open gas1 needle valve (13) and regulate the volume of O2 between 20 and 60 (indicator 6)
                  • once the pressure is stable again, switch on the generator (11) and set the timer (9) to 5 minutes (300 seconds)
                  • at the end of the process switch off the generator if you are using an external timer, switch off the pump,
                  • close the need valve (13)
                  • and ventilate the chamber (switch 12).

                   

                   

                  Second stage: bonding

                  at this point the machine is ready to perform plasma treatment on your sample. Note that if you have already done the cleaning of the chamber you do not have to repeat it in the same working session.

                  • put your samples (pdms, with the structers on the top, and glass) on the glass tray covered with an aluminium foil (fix with tape coverglasses on the foil otherwise they will fly away during the ventilation)
                  • insert the tray in  and close the chamber (3)
                  • turn on the vacuum pump (10) and wait until the pressure is around 0.4 mbar
                  • once the pressure is at the desired level open the needle valve (13) as you did for the cleaning
                  • wait until pressure stabilises around 0.4 mbar and then switch on the generator (11) for one minute
                  • at the end of the process switch off the generator if you are using an external timer, switch off the pump,
                  • close the need valve (13)
                  • and ventilate the chamber (switch 12).
                  • remove the tray from the chamber and put the pdms on the glass without pressing on it

                   

                  At the end of the working session please be sure that the O2 tank is closed and no residual oxygen is present in the circuit (indicators 6, 17, and 16 must be on 0).

                   

                  Enjoy,

                  Gianfranco

                  Stuff for microscope

                  • One stepper motor and other things from an old printer

                      • Transmission belts
                      • Pulleys
                      • Joints
                      • Disks

                      • Micro pumps controlled by NI board


                        • Kit PC CONTROL
                        1. Board
                        2. Motor

                        • Arduino
                        1. Kit Workshop with Arduino Board
                        2. Ethernet Board
                        3. +2 Arduino Uno
                        4. Proto Shield
                        5. Motor Shield
                        6. USB Serial Adapter

                          • Altra scatola di cinghie, pulegge e giunti.

                            Enzimi di Restrizione.xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 10 kB (10468 bytes)

                            Enzimi di Restrizione.xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 10 kB (10468 bytes)

                            smartseq

                            ProtocolSS4Nextera_1.pdf — PDF document, 54 kB (55719 bytes)

                            Norme Comportamentali

                            Rischi_Norme_Comportamentali.pdf — PDF document, 1038 kB (1063083 bytes)

                            Norme Comportamentali

                            Rischi_Norme_Comportamentali.pdf — PDF document, 1038 kB (1063083 bytes)

                            Norme Comportamentali

                            Norme comportamentali

                            Rischi_Norme_Comportamentali.pdf — PDF document, 1038 kB (1063083 bytes)

                            Enzimi di Restrizione (2).xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 10 kB (10499 bytes)

                            Restriction Enzymes

                            Enzimi di Restrizione (2).xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 10 kB (10499 bytes)

                            Restriction Enzymes

                            Enzimi di Restrizione (2).xlsx — application/vnd.openxmlformats-officedocument.spreadsheetml.sheet, 10 kB (10499 bytes)

                            Restriction Enzymes

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